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本制品是基于荧光探针检测的即用型PCR试剂盒，可以对靶片段进行实时定量PCR分析。产品含有经过优化的缓冲液组分、热启动Taq DNA聚合酶、Taq DNA稳定剂、dNTPs、MgCl₂和稳定剂等所有实时定量PCR所需要的成分，用户只需加入基因组DNA或cDNA模板、引物和探针即可进行探针法实时定量PCR反应，具有广泛的用途。

• 以2×PCR预混液提供，用户只需准备模板、引物、探针和ROX染料（取决于qPCR仪器）即可以进行探针法实时定量PCR实验，非常方便快捷，降低了操作误差。
  
• 各成分的浓度和比例都经过精心优化，反应的灵敏度高，特异性强。灵敏度最高时可以达到50拷贝/反应（跟模板质量，引物设计等相关）。
  
• 既可用于TaqMan探针qPCR，也可以是分子信标（molecuLar beacon）探针qPCR。
  
• 灵敏度和专一性比染料法荧光定量PCR更高。
  
• 可用于基因表达分析、SNP分析、拷贝数分析等实验。也可以用于定性检测。
  
• 本制品反复冻融20次对扩增效果没有任何影响。
  
• 本制品只能用于科研。

• 如果有N个样品并且做定量分析，最好设置N+7个反应，多出的7个中，6个是做标准曲线的阳性对照，一个是阴性对照（NC）。在N+7个PCR管中，加入下列成分。如果是做定性分析，则6个做标准曲线的样品缩减成一个阳性对照（PC），用户自己需要根据下表进行适当修改（把6个标曲反应改成1个阳性对照反应）。
  

  成分		N个样品管	6个标准曲线管	NC管
  2×Probe qPCR Mix		各10μL	各10μL	10μL
  自备引物1（10μM）		各1μL	各1μL	1μL
  自备引物2（10μM）		各1μL	各1μL	1μL
  自备 模板DNA	基因组DNA	10～100ng	不加	不加
  	cDNA	1～10ng	不加	不加
  自备阳性对照模板 (6个梯度)		不加	各1μL （各加1个梯度）	不加
  阴性对照模板（一般用水）		不加	不加	1μL
  自备探针（0.5μM）		各1μL	各1μL	1μL
  自备50×自备ROX I或ROX II		各0.4μL	各0.4μL	0.4μL
  超纯水		至20μL	至20μL	至20μL

• 放入荧光PCR仪中进行扩增，下表的扩增参数仅供参考，一定需要根据靶分子长度，引物和探针的Tm值、标记染料的种类等进行调节。
  
  • 一般选择三步法PCR：
    

    步骤	温度	时间	备注
    预变性	94℃	2min
    PCR反应 (35～45循环)	94℃	15sec	靶分子长度最好在80～200bp
    	55～65℃	15～30sec	在此步采集荧光信号， 通道根据标记染料决定
    	72℃	30sec

  • 如果引物Tm值接近60℃，也可以选择两步法PCR：
    

    步骤	温度	时间	备注
    预变性	94℃	2min
    PCR反应 (35～45循环)	94℃	15sec	靶分子长度最好在80～200bp
    	60℃	60sec	在此步采集荧光信号， 通道根据标记染料决定

• 数据处理：
  
  • 如果把本试剂盒用于定量检测，则以阳性对照浓度的log值为横轴，以Ct值为纵轴，绘制标准曲线。再以待测样品的Ct值从标准曲线上推算出样品DNA浓度的log值，再推算出其浓度。
    
  • 如果把本试剂盒用于定性检测，只判断阳性或阴性。一般情况下，阴性对照Ct大于或等于40。阳性对照必须有荧光对数增长，有典型扩增曲线，Ct值应该小于或等于30。对待测样品，如果其Ct大于或等于40则为阴性，如果小于或等于35则为阳性。如果在35～40之间，则重复一次。重复实验的Ct值如果大于或等于40则为阴性，如果小于40，则为阳性。

• 不需要ROX的机型：Agilent MX3000和MX4000、iCycler IQ、LightCycler 480、Smart Cycler System、Thermal Cycler Dice Real Time System等型号的荧光PCR仪器不需要加ROX染料，但加入的话也不会影响整个PCR分析。
  
• 需要使用ROX I的机型：ABI Prism7000、7300、7700、7900HT、Step One、Step One Plus。
  
• 需要使用ROX II的机型：ABI Prism7500、7500 Fast、MJ Opticon、MJ Chromo4、Corbett RotorGene 3000。